Cancer Discov︱张翔团队报道NG2+基质细胞在骨重塑和转移起始中的特殊作用

撰文︱张伟杰

责编︱王思珍，方以一

编辑︱王如华

骨转移（bone metastasis）是乳腺癌、前列腺癌、肺癌等多种癌症中最常见的转移类型，并与辅助治疗抗性和多器官扩散风险相关[1, 2]。骨转移的诊断依赖于不明原因的病理性骨折或疼痛等临床症状的出现。通常认为这些症状是由于转移肿瘤细胞、成骨细胞（osteoblast）和破骨细胞（osteoclast）之间的恶性循环（vicious cycle）破坏了骨骼完整性导致。近年的研究显示在临床转移被确诊之前骨中肿瘤细胞存在较长的无症状静息期[3]。在转移发生早期，血管周生态位（perivascular niche）和成骨生态位（osteogenic niche）分别调控了骨播散肿瘤细胞的静息和增殖状态[4,5]，然而这两种转移生态位是否存在时空上的相关性还不清楚。与此同时，骨微环境高度动态且异质，具有持续活跃的骨组织替换。在此过程中，间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）和内皮细胞通过精细的调控机制被招募到特定的骨重塑（bone remodeling）区域，间充质干细胞的分化直接介导了旧骨的吸收和新骨的形成过程。骨的重塑活动在病理性骨折损伤中更会显著增强。骨重塑造成的微环境扰动是否可以改变播散肿瘤细胞的命运从而影响肿瘤细胞在骨内的定植生长是理解和防治骨转移的重要一环。

2022年10月26日，美国贝勒医学院张翔教授课题组在Cancer Discovery上发表了题为“Bone metastasis initiation is coupled with bone remodeling through osteogenic differentiation of NG2⁺ cells”的研究。该研究结合多种转移模型、骨发育生物学实验手段和临床样本佐证，揭示了骨在稳态或病理情况下的重塑如何引发肿瘤细胞在骨内的转移复发，为进一步研究骨转移病因和流行病学提示了新的方向。

为了探讨骨重塑过程如何影响转移扩散，作者在小鼠Lewis肺癌自发转移模型的基础上引入骨损伤模型。实验结果显示，在移除皮下肿瘤的小鼠右腿骨引入骨损伤（钻洞或者折断）能够显著促进损伤部位的转移负荷，而未受损的左腿骨的转移生长并未受到明显影响（图1A），说明骨损伤通过一种局部作用机制促进转移。进一步的免疫荧光染色显示损伤部位富集Ki67+增殖肿瘤细胞，而在远离愈合组织骨痂(callus)的肿瘤细胞多保持静息状态（图1B）。之前有研究报道组织损伤造成的免疫反应可促进肿瘤复发，然而作者并未观测到主要免疫细胞群体的在损伤部位的浸润出现明显改变（图1C），相反Sca-1⁺或PDGFRα⁺成骨谱系前体细胞（含MSC）在callus组织中有明显的富集（图1D）。

图1 骨组织损伤激活肿瘤细胞增殖

（图源：Zhang WJ, et al., Cancer Discovery, 2022）

成骨前体细胞是非常宽泛且异质的细胞群体，现有研究已鉴定出多种定位不同且表达不同标志物的亚群，在骨发育的特定阶段或者特定部位分化为成骨细胞[6]。为了鉴定对骨损伤诱导的转移增强起关键作用的前体细胞亚群，作者利用白喉毒素（Diphtheria Toxin）介导的不同成骨前体谱系敲除小鼠模型发现只有NG2⁺谱系的消融能够显著抑制肿瘤细胞在骨损伤部位的生长（图2A, B）。有意思的是，在稳态情况下敲除NG2⁺谱系也可以降低骨转移的发生但不影响肺转移（图2C-E），说明NG2⁺谱系对肿瘤转移的调节具有骨组织特异性。更进一步的骨定植生长实验显示，NG2⁺谱系的消融不影响肿瘤细胞进入骨髓环境后的初始生存，但显著削弱了早期转移负荷的扩增速度（图2F）。

图2 NG2⁺谱系敲除抑制骨转移发生

（图源：Zhang WJ, et al., Cancer Discovery, 2022）

NG2蛋白是血管周细胞（Pericyte）及H型成骨血管（Type H vessel）周围基质细胞的标志物之一，是骨间充质干细胞(BMSCs)的重要来源[7,8]。作者在体外分化实验显示NG2⁺骨基质细胞具有成骨、软骨或脂肪三系分化潜力（图3A）、较强的集落生成能力和高表达MSC干性基因，说明其符合MSC的体外定义。然而在小鼠体内进行的谱系示踪实验中作者发现该亚群仅能分化出成骨细胞（图3B）。NG2⁺谱系的消融同时降低了稳态下活跃成骨单元和破骨单元的密度（图3C, D），新骨生成和病理性骨损伤修复的速度也明显削弱（图3E, F），进一步说明NG2⁺亚群直接参与了生理和病理情况下骨的重塑过程。

图3 NG2⁺MSC直接参与骨重塑过程

（图源：Zhang WJ, et al., Cancer Discovery, 2022）

接下来，一个重要的问题是NG2⁺细胞如何调节早期骨转移的发生。作者决定从NG2⁺细胞和早期播散肿瘤细胞在骨内的分布入手。为此，作者结合免疫荧光染色、组织透明化技术（图4A）和3D成像技术（图4B），发现相比于模拟情况下的随机分布，更高比例的骨微小转移灶存在于离NG2⁺细胞的较近空间距离内（<10微米）（图4C），且肿瘤细胞与NG2⁺细胞存在广泛的细胞-细胞直接接触。有意思的是，骨微小转移灶的大小和其与NG2⁺细胞的空间距离成负相关关系，说明转移灶与NG2⁺细胞的接触促进其生长。

图4 NG2⁺MSC与早期骨转移肿瘤细胞共定位

（图源：Zhang WJ, et al., Cancer Discovery, 2022）

这种共定位关系赋予肿瘤细胞的生长优势的分子机制是什么？作者发现除一种小鼠乳腺癌EO771细胞外，其他8种小鼠肿瘤细胞（包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肠癌）都能够在体外与骨基质细胞的悬浮共培养中获得生长受益（图5A）。这其中5种表达上皮细胞标志物E-cadherin的小鼠肿瘤细胞在共培养时会形成双层球囊结构（图5B）。除4T1.2细胞外，其他4种肿瘤细胞与NG2⁺细胞共培养时相比NG2^-细胞能够获得额外生长优势（图5A）。利用Boyden小室分隔共培养体系中的骨基质细胞和肿瘤细胞，作者发现NG2⁺细胞赋予的肿瘤细胞生长优势消失，说明NG2⁺细胞促肿瘤生长依赖于细胞-细胞之间的直接接触（图5C）。之前的研究显示上皮肿瘤细胞的E-cadherin和MSC的N-cadherin可以形成异型粘附连接（heterotypic adherent junction，hAJ），从而激活下游促增殖的mTOR通路[5]。作者发现NG2⁺亚群高表达N-cadherin，在共培养体系中与接触的上皮肿瘤细胞之间存在hAJ（图5D），并且促进肿瘤细胞中mTOR通路的激活水平（图5E）和增殖细胞的比例（图5F）。

图5 与NG2⁺MSC的直接接触促进肿瘤细胞增殖

（图源：Zhang WJ, et al., Cancer Discovery, 2022）

有意思的是，作者发现经过成骨分化诱导的NG2⁺细胞对肿瘤细胞的生长刺激作用可以进一步增强（图6A）。这一观察与MSC成骨分化过程中N-cadherin表达水平进一步上调相吻合（图6B），提示N-cadherin可能同时具有促转移和促成骨分化的作用。实验显示在NG2⁺谱系中特异性敲除N-cadherin可以显著削弱生理情况下的新骨形成和病理损伤的修复速度（图6C, D）。另外，在小鼠体内NG2⁺细胞敲除N-cadherin也减缓了骨转移在损伤部位的生长（图6E）。最后，作者在收集的病人骨转移样本观测到肿瘤细胞与NG2⁺细胞的直接接触（图6F），并在若干骨转移相关测序数据集中证实了上述机制与转移的不良表型相关（图6G）。

图6 N-cadherin调控NG2⁺MSC的成骨分化和转移起始功能

（图源：Zhang WJ, et al., Cancer Discovery, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究发现NG2⁺间充质干细胞连接了骨的重塑和转移起始过程。研究所揭示的骨组织更新和转移复发的相关性为一些临床观察提供了合理的解释。比如，发生过骨折的早期无转移病人随后发生转移的风险增加；在一些安装种植牙的肿瘤病人中发生非常少见的口腔转移；治疗骨转移的双磷酸盐类药物只在骨重塑活性更活跃的绝经后妇女中提高存活时间等。NG2⁺细胞与肿瘤细胞一样定位于血管周边，说明血管周生态位与成骨生态位存在空间重叠的。与其他亚群相比，NG2⁺细胞主要定位于骨内膜（endosteal）区域，而该区域也是绝大部分播散肿瘤细胞的最初存在场所。同时NG2⁺细胞高表达能细胞接触粘附分子N-cadherin。空间上的共定位和细胞接触机制共同介导了NG2⁺细胞的促骨转移表型，然而这种巧合是如何形成有待进一步研究。这一研究也初步提示了肿瘤细胞与微环境互动的多样性，对其他类型的细胞-细胞接触形式及其调控组织稳态、肿瘤复发的机制需要更为深入的研究。

原文链接：https://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-abstract/doi/10.1158/2159-8290.CD-22-0220/710013/Bone-metastasis-initiation-is-coupled-with-bone?redirectedFrom=fulltext

第一作者：张伟杰（左）；通讯作者：张翔（右）

（图片提供自：张翔团队）

作者简介（上下滑动阅读） 

张伟杰博士毕业于中国科学技术大学，在Cell、Cancer Discovery、Nature Cell Biology、Development Cell等杂志发表多篇关于骨转移和骨髓微环境的第一或共同第一作者文章。近期加入浙江大学生命科学研究院组建独立实验室，欢迎对癌症转移研究有兴趣的同学联系加入。

张翔博士目前是贝勒医学院Lester and Sue Smith Breast Center代理系主任、McNair Scholar和William T. Bulter Endowed Chair for Distinguished Faculty，并曾获得Era of Hope Scholar、Sue Eccles Young Investigator Award、Laura Zisken Prize等多个癌症研究奖项。现主持多个NCI和DOD乳腺癌研究项目，相关研究多发表在Nature、Cell、Cancer Cell、Cancer Discovery、Nature Cell Biology和Nature Cancer等顶尖杂志。

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参考文献（上下滑动阅读）

[1] Bado, I.L. et al. (2021) The bone microenvironment increases phenotypic plasticity of ER+ breast cancer cells. Dev. Cell 56, 1100-1117.e9.

[2] Zhang, W. et al. (2021) The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell 184, 2471-2486.e20.

[3] Sosa, M.S. et al. (2014) Mechanisms of disseminated cancer cell dormancy: an awakening field. Nat. Rev. Cancer 14, 611–22.

[4] Ghajar, C.M. et al. (2013) The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat. Cell Biol. 15, 807–817.

[5] Wang, H. et al. (2015) The Osteogenic Niche Promotes Early-Stage Bone Colonization of Disseminated Breast Cancer Cells. Cancer Cell 27, 193–210.

[6] Méndez-Ferrer, S. et al. (2015) Bone marrow stem cells: current and emerging concepts. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1335, 32–44.

[7] Crisan, M. et al. (2008) A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell 3, 301–313.

[8] Kusumbe, A.P. et al. (2014) Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature 507, 323–328.

本文完